جدول المحتويات
معلومات حول اختبار PCR
مع تقدم الطب والعلوم تشهد الفحوصات الطبية موجة من التقدم والإبداع، ومعظم الأمراض اليوم لديها فحوصات محددة أو على الأقل مستهدفة تساعد في تأكيد تشخيص الإصابة، وفي ظل الانتشار الحالي لفيروس كورونا المستجد يتحدث العديد من الأشخاص حول العالم حول اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل بقدرته على تشخيص المرض، إذ يعتمد هذا الفحص بشكل أساسي على التركيز على الجينوم والحمض النووي للبكتيريا أو الفيروس، حيث يعمل على تضخيم جزء صغير من شريط الحمض النووي وعمل آلاف النسخ منه، ومن الجدير بالذكر أنه تمّ استخدام هذا الفحص في التحقيقات والجرائم، وللقيام بهذا الاختبار يجب توافر شروط معينة، مثل وجود درجة حرارة تتغير حسب خطوة الاختبار، ويتميز هذا الفحص بسلسلة من العمليات البيولوجية الدقيقة، مما يعني وجود دقة عالية في نتائجه، وفي هذه المقالة سيتم طرح جميع المعلومات المتعلقة بهذا الفحص[1]
يعد هذا الاكتشاف اختراق كبير في مجال الطب التشخيصي، حيث ساهم اكتشاف اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل في تطوير البيولوجيا الجزيئية، كما أنه حقق خطوات كبيرة في الطب الشرعي والتشخيص الطبي وعلم الأحياء التطوري، حيث تمكن العلماء من تضخيم قطعة صغيرة من الحمض النووي البشري وتحويله إلى قطعة كبيرة تجرى عليها عدة تجارب، وقد تم تطوير هذا الاختبار عام 1983 من قبل عالم الكيمياء الحيوية كاري موليس، وحصل على جائزة نوبل لاكتشافه بعد عشر سنوات، وهذا الاكتشاف غير النظرة الطبية لأشياء كثيرة[2]
خطوات القيام بفحص PCR
يتطلب هذا الاختبار توافر خمسة مكونات أساسية لإكمال المهمة، وهي قالب الحمض النووي المراد نسخه والبادئات التي تشكل أجزاء قصيرة من الحمض النووي، وتسمى البادئة لأنها موجودة في بداية اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل، وتعمل هذه البادئة على ربط جزأين من الحمض النووي ليتم نسخهما معًا، وهناك حاجة لقواعد الحمض النووي مثل التيمن والجوانين والسيتوزين والأذينين، والتي تشكل خيطًا جديدًا من الحمض النووي، وتتم إضافة هذه القواعد عن طريق تنشيط إنزيم البوليميراز، وهناك حاجة إلى توفر المخزن المؤقت الذي يضمن بيئة حاضنة مناسبة للتفاعل، وفيما يلي مزيد من التفاصيل حول هذه الخطوات وما يدخل فيها:[1]
مرحلة الإفساد
خلال هذه المرحلة يتم تسخين الحمض النووي والمكونات الأساسية إلى درجة حرارة 95 درجة مئوية، حيث تتسبب هذه الحرارة في انهيار الروابط الهيدروجينية بين خيوط الحمض النووي وبالتالي فصلهما، وكل من هذين الخيطين سوف يعمل لإنتاج سلاسل DNA جديدة، وتستغرق هذه المرحلة ما بين 15-30 في الثانية.
مرحلة التلدين
عند هذه النقطة يحدث انخفاض في درجة الحرارة يصل إلى 65 درجة، مما يجعل البادئة قادرة على الارتباط بقالب الحمض النووي ومن خلالها يتم إضافة القواعد وربطها ببعضها البعض بواسطة روابط هيدروجينية، والتي تربط كل قاعدة بأي نوع يناسبها، وعلى الجانب الآخر يتم بناء خيط جديد من الحمض النووي من خلال النموذجين في اتجاهين متعاكسين، مما يعني وجود اثنين من البادئات في اتجاهين متعاكسين، وتستغرق هذه المرحلة حوالي 30 ثانية.
مرحلة التمديد
تعود درجة الحرارة وترتفع إلى 72 درجة مئوية لتصنيع إنزيم Taq DNA polymerase، حيث يتم أخذ هذا الإنزيم من البكتيريا المحبة للحرارة، وبالتالي فهو قادر على تحمل درجات الحرارة المرتفعة، ويساعد هذا الإنزيم في تكوين خيط DNA جديد وربطه بالخيط الرئيسي، وبالتالي تكوين جزيء DNA مزدوج ،تختلف مدة هذه الخطوة حسب طول الشريط المراد نسخه، ولكنها تستغرق عادةً دقيقة واحدة.
ما هي استخدامات PCR
يعتبر هذا الاختبار من الاختبارات الحساسة للغاية ، ويجب على المسؤولين توخي الحذر الشديد لتجنب تلوث العينة، مما قد يؤدي إلى وجود نتائج مضللة، وربما تم استخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل في مواضيع لا حصر لها، من اكتشافها حتى هذا الوقت كانت الأمراض الوراثية مثل التليف الكيسي من أهم استخدامات هذا الاختبار، ويستخدم هذا الاختبار لكل مما يلي:[3]
- تشخيص الأمراض: من خلال هذا الاختبار يستطيع الأطباء تشخيص بعض الأمراض، مثل السرطان ومرض لايم من خلال الكشف عن العامل المسبب كان هذا الفحص دقيقًا جدًا في تأكيد الإصابة بعدة أمراض بكتيرية وفيروسية، ومن أهمها مرض نقص المناعة المكتسبة، والتي تم اكتشافها مبكرًا حتى قبل تكوين الأجسام المضادة بواسطة الخلايا المناعية، أي بعد أيام قليلة من الإصابة، وكان هذا الاختبار مفيدًا أيضًا في تشخيص مرض السل الذي ارتبط بفيروس نقص المناعة البشرية في الآونة الأخيرة، لأن هذا الاختبار ساعد في الكشف عن مقاومة الأدوية المضادة لمرض السل، مما يعني أن هناك نوعًا جديدًا من العدوى الفطرية يختلف عن النوع المعروف، كما أنه ساعد في التفريق بين السل والالتهاب الرئوي اللانمطي[5][4]
- تحليلات الطب الشرعي: الاعتماد على تضخيم جزء من الحمض النووي من الدم والحيوانات المنوية وجذور الشعر مما يساعد في الكشف عن القضايا المتعلقة بالجريمة والتعرف على المفقودين والمجرمين، وقد تم استخدام هذا الاختبار لتأكيد الأبوة عند الأطفال[2]
- مطابقة الأنسجة في التبرع بالأعضاء: من شروط قبول الزرع وعدم رفضه من قبل الجهاز المناعي وجود تطابق في عدد من الجينات بين المتبرع والمتلقي، ولتحقق من هذه الجينات يستخدم فحص PCR يستخدم لضمان وجود أقل عدد ممكن من هذه الجينات[2]
- إجراء البحث: ساعد اكتشاف هذا الاختبار في دراسة الكائنات المنقرضة بالاعتماد على عينات مأخوذة من عظامها[2]
اختبار RT-PCR
هذا ما يسمى النسخ العكسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل، والمعروف باسم عكس لأنه يعتمد على وجود mRNA، أو ما يسمى بـ messenger RNA كقالب لنسخ وتشكيل مكمل الحمض النووي، وهذا الشريط الجديد يسمى الشريط التكميلي cDNA، ثم يتم تحويله وفقًا لإنزيم بوليميريز RNA إلى DNA ثنائي الطبقة، ثم يتم استخدامه هذا الحمض النووي في فحص PCR، ويستخدم RT-PCR للكشف عن وجود mRNA في العينة، وبالتالي فهو واسع الانتشار ويستخدم لتشخيص الإصابة بفيروس التهاب الكبد الوبائي C والذي يكون الحمض النووي الخاص به هو RNA، ويمكن لهذا الاختبار تشخيص الإصابة بالفيروس حتى مع وجود عدد قليل منه داخل الجسم، حيث يعتبر أفضل اختبار للكشف عن وجود العدوى من الأم إلى الطفل في الفترة المحيطة بالولادة فيما يتعلق بعدوى التهاب الكبد C، لأنها استُخدمت لتأكيد انتقال نوع معين من الكروموسوم[6]
اختبار PCR لفيروس كورونا
في الوقت الحالي يعد اختبار RT-PCR هو الاختبار الأكثر استخدامًا لتشخيص عدوى فيروس كورونا المستجد، ويتم تطبيق هذا الاختبار على عينة مأخوذة من الجهاز التنفسي العلوي أو السفلي من خلال مسحة من البلعوم الأنفي، أو بعد تلقي جهاز تنقية الشعب الهوائية، ويتم إجراء هذا الاختبار على المرضى المعرضين لخطر الإصابة بهذا المرض، وأولئك الذين لديهم تاريخ في السفر إلى منطقة مصابة أو مخالطة شخص مصاب، والنتيجة الإيجابية من هذا الاختبار تشير إلى وجود عدوى كورونا، لكن هذا لا يستبعد وجود عدوى فيروسية أو بكتيرية متورطة بهذا الفيروس، بينما النتائج السلبية لا يمكن أن تؤخذ في الاعتبار بهذا المرض مما يعني وجود سلبية كاذبة ، حيث يجب الجمع بين النتائج المخبرية والأعراض السريرية والمعلومات الوبائية لتحقيق نتيجة مثالية، ومن المهم الحفاظ على نظافة العينة والأدوات المستخدمة أثناء الفحص التي تتطلب طرق تعقيم خاص، وتاريخ صلاحية المواد المستخدمة في الاختبار، وعدم استخدام مواد تخص أكثر من شركة لضمان الحصول على أفضل النتائج وتجنب الوقوع في أخطاء تشخيصية[7]
ما مدى دقة اختبار PCR
في السنوات الأخيرة نظرًا لاستخدام اختبارات متعددة لتشخيص المرض أو اكتشافه كان شاغل العلماء الأكبر هو دقة هذا الاختبار ومدى اعتمادهم عليه لإعطاء نتائج حتمية، ولتأكيد دقته هناك معياران لدراسة دقة المقايسة وهما حساسية ونوعية المقايسة من أجل تحقيق أفضل دقة لهذا الاختبار، ويمكن تفسيرها على النحو التالي:[8]
- يعتبر اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل دقيقًا جدًا إذا كان قادرًا على إنتاج أكبر عدد من الحمض النووي بأقل عدد ممكن من الدورات، ولتحقيق هذه النتيجة يجب ضبط درجة الحرارة وظروف العزل بهذه الطريقة المثلى.
- يمكن الحصول على فحص دقيق للغاية إذا تم إجراء الاختبار على قطعة صغيرة من الحمض النووي، ويجب تنقية الحمض النووي المكبر عن طريق إزالة المجالات غير المحددة الناتجة عن عملية التضخيم.
- يمكن زيادة دقة هذا الفحص بإضافة مواد معينة تسمح للبادئة بالوصول بسهولة إلى الموقع المحدد، بما في ذلك الجلسرين والفورماميد، أو الوصول إلى درجة حموضة منخفضة، وبالتالي يمكن القول أن مدى دقة هذا الفحص ليس مطلقًا، ولكنه يعتمد على توفر الظروف المناسبة لهذا الغرض.
مزايا اختبار PCR
توجد هذه النقاط الإيجابية في فحص تفاعل البوليميراز المتسلسل مهما كان سبب إجرائه، ولعل التطور الكبير في هذا المجال ومحاولة العلماء لتحقيق اختبار بدرجة عالية من الحساسية والنوعية هو السبب وراء ذلك، ومن أهم المزايا التي يتمتع بها هذا الاختبار ما يلي:[9]
- السرعة والبساطة في تحقيق النتيجة، لأنه بفضل هذا الفحص يمكن الحصول على كمية كبيرة من المادة الوراثية جاهزة للدراسة في غضون ساعة، والتي كان من المفترض أن تتضاعف هذه المرة باستخدام الاختبارات القديمة السابقة.
- يتطلب هذا الاختبار كمية صغيرة من الحمض النووي لإعطاء النتائج، حيث يكفي الحصول على نسخة من الحمض النووي بشرط أن تكون كاملة وغير تالفة، وبالتالي فهي قادرة على دراسة كل جزء منه.
- يمكن لهذا الاختبار الكشف عن أي طفرات جديدة تحدث في فيروس نقص المناعة البشرية، ومن المعروف أن الفيروسات قادرة على تكوين أنماط مستضدية جديدة من وقت لآخر، وبالتالي فإن التطور المستمر للفيروس لا يشكل عبئًا في التشخيص.
- يقوم هذا الاختبار بتضخيم الجزء المستهدف فقط من الحمض النووي، وبالتالي فهو يتمتع بدقة عالية فيما يتعلق بالهدف.
- استعباد هذا الاختبار الإيجابيات والسلبيات الخاطئة المتعلقة بفيروس نقص المناعة البشرية.
عيوب اختبار PCR
على الرغم من قدرة اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل على الكشف عن العديد من الطفرات وتأكيد الإصابة بأمراض فيروسية، إلاّ أن له العديد من العيوب، والتي ترتبط غالبًا بخطوات التحضير لهذا الاختبار، والتي تتطلب دقة شديدة في التنفيذ، ويمكن أن تكون السلبيات على النحو التالي:
- يعمل اختبار PCR في ظروف خاصة جدًا، ويتطلب طولًا معينًا من تسلسل الحمض النووي المستهدف، وعلى سبيل المثال إذا تم الحصول على تسلسل طويل جدًا، فمن الصعب التأكد من أن جميع المعلومات قد تم نقلها بدقة، وبالتالي استهداف الحمض النووي قد يتم تجاوز المناطق التسلسل يتطلب دراسة حقيقية.
- إذا ظهر البادئ أكثر من مرة في تسلسل الحمض النووي، فقد يؤدي ذلك إلى وجود هذا البادئ في أكثر من مكان، مما يؤدي إلى وجود عدة نسخ متطابقة من هذا الحمض النووي، أو وجود نسخة خاطئة قد تعطي خطأ نتائج سلبية.
تكلفة اختبار PCR
ساهم اكتشاف اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل في اكتشاف عدة أنواع من الفيروسات حتى هذا الوقت، مما ميز هذه المراجعة عن باقي الاختبارات التي تم استخدامها لمئات السنين، ومن أشهر الفيروسات التي تمّ الكشف عنها من خلاله فيروس التهاب الكبد الوبائي وفيروس نقص المناعة البشرية، كما تم تحديد أنواع الفيروسات التي تصيب النباتات من خلال هذا الاختبار، ومن الجدير بالذكر أنّ تكلفة هذا الفحص حسب السبب المطلوب، وتتراوح التكلفة بين 15 دولارًا و 30 دولارًا، وتصنف تكلفة إجراء هذا الفحص تبعًا للمجموعات التالية:[11][10]
- تكلفة 15 دولار: توجد هذه التكلفة في الفحص للكشف عن الكلاميديا أو ما يسمى بالكلاميديا والتي غالبا ما تكون موضعية في الكبد أو المشيمة، وتنعكس هذه التكلفة في فحص الكشف عن المكورات الرئوية وتمايزها عن باقي أنواع المتفطرات والكشف عن السالمونيلا.
- تكلفة 25 دولارًا: تقدر تكلفة تشخيص عدوى فيروس الأنفلونزا بأشكاله المختلفة بـ 25 دولارًا.
- تكلفة 30 دولارًا: تم تضمين هذه القيمة في اختبار بكتيريا Clostridium و Escherichia coli.
